光學顯微鏡使用可見光進行照明,用光學透鏡進行聚焦,人眼或者 CCD/CMOS 相機進行觀察.基本的明場照明顯微鏡由光源、目鏡、物鏡、載物臺、聚光鏡、光圈等部件組成.收到衍射效應的限制光學顯微鏡的分辨率極限, 其中聚光鏡NA 是數值孔徑(Numerical Aperture)為物鏡與樣品間介質折射率以及孔徑角正弦值的乘積是光學顯微鏡重要的參數之一.阿貝極限將光學顯微鏡的分辨率限制在約200納米處. 為了提高顯微鏡的成像素質,擴展應用范圍,光學顯微鏡經過不斷的發展改進,已經成為現在產品品質保證必要一種光學設備.

光學顯微鏡的成像手段:

普通寬場成像 (Wide field) :光學顯微鏡基本的成像光路全內反射熒光(TIRF):利用光在介質界面發生全反射,在表面形成倏逝波的特性,只對樣品表面200nm 左右深度內進行成像,隔絕來自焦外光線的干擾.

共聚焦(Confocal):利用空間針孔對焦外光線進行隔絕,對樣品進行逐點掃描成像,大大提高z軸分辨率..

多光子(Multi-Photon):利用長波長的光波繞射能力強,穿透能力高的特性,讓熒光分子同時吸收多個長波長光子激發短波長熒光,從而實現使用較低能量的光照來對厚樣品成像.目前成像的深度已經達到毫米級別.

光片 (Light sheet):對垂直于物鏡光軸的切片進行照明,避免了對焦外部分樣品的照明,大大提高z軸分辨率,同時相對 confocal 成像速度更高.

結構光 (Structured light):將照明光進行正弦調制或其它形式的調制形成結構光照明,與樣品表面形成摩爾紋,使得一部分高頻信息能夠被觀察到.這種方法高能夠提升兩倍的分辨率,屬于一種超分辨技術.

受激發射損耗 (Stimulated Emission Depletion, STED):熒光顯微鏡中激發光由于衍射效應,在樣品上形成的是一個亮斑,亮斑內的熒光分子均被激發產生熒光,STED在激發光上嵌套一個環形光,使對應環形區域的分子發生受激輻射而不產生熒光,只有中心區域分子產生熒光,從而突破衍射極限限制的分辨率.STED的分辨率可以達到30nm左右.

  隨機光學重構 (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM):隨機激發單個熒光分子,對其光斑進行擬合得到中心分子的位置,不斷隨機激發分子并將得到的圖案疊加,得到超越衍射極限分辨率的圖像,STORM的分辨率可以達到20nm左右.